【摘 要】 全球性的环境污染一定程度上改变了自然地理环境， 使植物种群面临一个全新环境。污染敏感种逐渐消失，抗性种质被保存并得以进化。因此，植物的分化进化研究成为进化生态学的重要领域。 同工酶、RFLP、PCR、RAPD等分子生物学技术已成为重要研究手段并广泛应用于植物抗性进化研究中。

【关键词】分化进化进化生态学分子生物学技术环境污染

工业革命以来，人类经济活动大大改变了地球环境面貌，其变化速度和程度是生活演变与进化过程中最为激烈的一个时间阶段。 目前地球各个角落都程度不同地受到了污染，这种遍布全球、旷日持久的环境污染，使现存生物面临一种全新的生态环境[1、2]。

污染胁迫最显著效应就是消除敏感种或个体，改变生物群落物种构成[3]。与自然进化相比，抗污染进化是工业化以来自然界一切生物所面临的特殊进化过程[3、4]。在此情形下，植物如何进化、适应？如何影响生态系统完整性和生物多样性？对当今世界作物育种提出了什么现实问题？这些都关系到人类活动下生物圈既定机制维持的重大问题[3、5] 。植物进化研究，为上述问题的解决提供了可能途径，这也正是植物抗性分化进化研究近二十年来在进化生态学领域中异常活跃的重要原因。

1 植物污染进化生态学研究现状

总体上看，抗污染进化研究的历史不足五十年。50年代Ford和Kettlewell 首先对英国矿山"工业黑化"现象进行了研究[6]，开辟了抗性分化进化研究之先河。但由于认识和研究手段的局限性，直到80年代分子生物学技术日臻完善，相关分化进化研究才得以广泛开展，人们对污染效应的认识才转移到污染对生物的进化效应。通过比较国内外抗污染进化研究资料可看出，对抗性分化进化研究基本上是从宏观到微观、从外部数量性状到内部生理生化、进而深入到核内基因水平上，即主要有三个层次：①外部数量性状分化。②蛋白质多态性研究。③分子水平上的基因、DNA、RNA序列多态性研究。

1.1 外部数量性状研究

早期的环境生物学或污染生态学对污染的生物学效应研究， 主要集中在污染物在生物体内的迁移、转化、富集以及对生物体的生理生化机制方面的研究[4、7、8]。 王焕校等[9、10]研究了重金属在水生维管植物绿藻中的迁移积累；吴玉树等[11]对重金属在生态系统中迁移积累进行了研究。与此同时,一些学者对植物在污染条件下数量性状（如根长、株高、结实率、花粉活力等）的分化进行了探讨[12、13]。 段昌群等[5、14、15]通过4代原位种植实验，在人工控制的Pb、Cd、Hg、Zn复合污染条件下对同一蚕豆种质在株高、首次开化时间、种子重量、根长、根重等数量性状进行了分化研究。结果表明，植物对污染具有相当大的适应潜力，这种潜力表现在外部生理形态性状上，但这些分化最终可能源于基因频率及基因突变基础上。

1.2 蛋白质多态水平的研究

对蛋白质水平研究主要涉及同工酶、等位酶、植络素、类金属硫蛋白等的研究。王焕校等[16]对绿藻镉蛋白及其抗镉性进行了探索，其他一些学者还从抗性产生的生理机制方面进行了研究。他们发现类金属硫蛋白(Metallothioneis,MIT)、植络素(Phytochelatins,PCL)在植物抗污染生理活动中具有重要作用[17]。资料表明钙结合蛋白(CaM)和醇脱氢酶(ADH)功能变化一定程度上反应了植物抗性变化。段昌群[14]对在不同污染历史的同一品质玉米、曼陀罗中15个等位酶进行了电泳分析，最后通过模糊聚类、主成分分析、摄动分析等综合评判，探讨了这些物种在重金属污染下遗传杂合度、基因频率变化，发现金属污染下在几十年引起的进化速度和强度相当于自然进化过程几十万年的速度和强度。

1.3 核酸基因水平研究

目前直接从核酸水平进行植物抗性进化研究尚少见报导，然而国内外众多学者已对此研究引起了高度重视。一般认为植物抗性分化进化具有可遗传性并表现出明显数量遗传特性[3、5]。Bradshow[18]首先对金属采集地上抗性种群的建立发展及有关生态遗传学进行了研究，Prat揭示了金属抗性的可遗传变异,Gebarek研究了Picea abies在SO2污染条件下的叶片生活型性状的遗传变异及杂合度,Gregorius[19] 探讨了物种多样性对环境污染抗性适应的意义，Berginann研究了SO2对Picea abies的生态选择作用。到90年代初Taylor G.等[18].通过大量比较研究,并综述了有关领域的研究成果指出环境污染区域性是大量污染敏感种灭绝的主要原因,并且认为是物种多样性和遗传多样性丧失的重要原因之一。上述说明植物抗性进化研究的深入必须从其本质入手，即基因突变、碱基缺失、插入、重组及跳动基因方面进行，这样才能更清楚的揭示分化进化本质。

1.4 抗性进化的遗传机理

有关抗性进化的遗传机理目前研究甚少。从积累的资料表明，植物抗性进化一方面由于污染引起基因碱基的缺失、插入、重复从而引起遗传结构上的变异[3-6]；另一方面环境饰变也作了不同程度的贡献。对于遗传结构变异引起的性状进化机理不同学者又有较大的分歧。Macnair (1991)通过大量深入的理论推导认为，抗性进化性状是受某一主基因控制；而大多学者则认为植物抗性性状是由众多微效多基因控制，环境污染诱导了群体内众多不同基因的差异表达。这些基因有些来自?quot;休眠"态基因，即KIMUPU的"中性基因"；有些抗性基因原来以极低的频率存在，在污染选择下它能在短短几个世代内迅速扩大基因频率，从而提高了群体对污染的高抗性。

对抗性进化的遗传机理研究，只有在宏观生态遗传学的背景下，利用分子生态学及分子生物学技术手段，获得与污染相关的具体频率资料，才能充分地说明污染对生物的可能进化效应，有关这方面工作，正有待于分子生物学技术的引入并进一步深入开展[3-6,15,19]

2 分子生物学技术在植物污染进化生态学研究中的应用

长期以来人们凭借形态特征和数量变化来进行植物抗污染生态分化研究，但对许多深入的研究却无能为力。目前，分子生物学技术日趋成熟并已大量运用于污染进化生态学研究中。这些技术的引入为传统分化进化研究打开了新局面，为进一步从本质上揭示污染条件下植物进化提供了可能。只有将分子生物学技术引入植物抗性进化研究中，将宏观与微观结合起来我们才有可能使许多问题得以解决[19]。同工酶、等位酶电泳技术的完善，作为第一代分子生物学标记的RFLP技术，以及近年来PCR技术的成熟和RAPD技术在国内外迅速发展，为实现上述研究提供了迅捷可靠的工具。

2.1 同工酶电泳技术

同工酶作为基因产物的蛋白质，其结构的多样性在一定程度上反映出不同种群在不同污染历史条件下分化进化上DNA组成和生物体遗传多样性。同工酶之所以作为分化进化的重要研究对象，首先是因为它在品种间有丰富的多样性。目前一半以上的酶类存在同工酶类。其次，同工酶易于检测出。同工酶虽然由单拷贝基因编码，但通过酶染色放大作用同样易于检测出。

等位酶作为一种特殊形式的同工酶，它由一个基因位点、不同等位基因编码。根据等位酶谱带的遗传分析确定出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的遗传相似度或遗传距离，再根据遗传距离分析植物对污染的适应过程中遗传结构变化，依据分子钟进化理论计算出遗传进化的理论时间，从而评估污染对植物进化影响的速度和强度[8、14]。目前的研究结果表明，经历污染时间越长，居群间的遗传相似系数就越小[5,14,21]

Mejnartowicz[24]利用同工酶技术发现受氟化物、SO2污染的苏格兰松F1代某些基因和基因型大为减少，Muller-Starck等[22]利用同工酶技术研究表明欧洲山毛榉同工酶平均每个位点基因数目随污染而下降，Scholz等[23]检测了挪威云杉对SO2敏感性各不相同的一系列无性系的若干同工酶位点，也证明一定量的遗传信息有因污染而丧失的危险性[20-22]。但是，由于种群杂合性影响，某些同工酶分析显示了相互矛盾的结果， 这表明同工酶技术所揭示的与污染胁迫的植物遗传变异的复杂性[3、15、21、25]。

2.2 RFLP技术

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma,限制性内切酶片段长度多态性)作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。

与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的[26]。

2.3 PCR技术

PCR(Ploymerase Chain Reactions,聚合酶链式反应)自80年代中期问世以来，以其快速、简便、灵敏、特异等特点受到分子生物学界极大青睐，已广泛用于基因工程、临床检验、环境生物监测以及进化生态学中核酸水平的基因多态性等研究领域。

PCR由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸三部反应构成一个扩增循环，使目的DNA片段得以迅速扩增。这一技术能选择性富集一个特异DNA序列，并成106扩增。PCR 扩增技术与RFLP结合使用其用途更为广泛，PCR技术主要优点有：①PCR与DNA测序结合，扩增后无需再克隆，纯化即可直接测序。②可扩增一个只知基因一侧或两侧碱基序列的基因。 ③可进行DNA多种突变的测定，如碱基互换、缺失、插入型突变[16]。PCR 近几年已逐渐引入到植物抗污染进化研究领域中，并表现出强大的应用潜力。

2.4 RAPD技术

1990年Williams和Welsh等[27、28]运用随机扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记， 并将此法命名为RAPD法(Random Amplified Polymorphism DNA,随机扩增多态性DNA) 。尽管RAPD技术诞生时间不长，但由于其独到的DNA 多态性及快速和比PCR更简便等特点，使它成为基因组遗传图谱构建；基因定位及进化生态学研究中最为重要手段之一。

RAPD与PCR、RFLP、DNA指纹图技术相比，它有如下特点：①RAPD 技术可在对受试物种缺乏任何分子生物学研究背景下，直接对基因组进行多态性分析。②操作简单；一次 RAPD扩增实际就是一次简单的PCR反应，适合大量的样本快速分析。③所需模板DNA量极少； 一般一次扩增只需10-50ngDNA，这对于濒危动植物的基因组分析是十分有效的[27、29-31]。④与RFLP相比，RAPD可免去探针克隆与分离过程，不需进行DNA序列分析。⑤RAPD同时适用于基因组的单拷贝区域或重复序列区。

RAPD在植物抗污染进化研究中具有重大推动作用。利用RAPD 分析矿区不同重金属污染历史下作物DNA结构多样性，从中可试图找到对重金属污染具有抗性的DNA片段或基因组。这些研究虽然在国内外刚刚起步，但这些工作直接从分子水平上分析污染条件下种群遗传结构上的分化进化，在理论上具有广阔的研究前景和意义。

2.5 核酸序列测定

核酸序列测定包括DNA和RNA序列的测定。由于rRNA基因较保守，因此分子生物学中更重视rRNA基因的测定。在植物抗污染进化研究中主要运用叶绿体4.5SrRNA、5SrRNA 及胞质5SrRNA基因，然而，核酸序列的测定在植物抗性分化进化研究中尚未见报导， 此项技术在实际操作和运用上还有待于进一步完善。

3 结语

近二三十年来分子生物学技术迅速成熟为植物抗污染进化研究提供了极为重要的研究工具和手段，为传统的抗性研究打开了新的局面。同时，植物抗性进化研究为生态遗传学、进化生态学以及作物选择育种提供了背景材料和研究窗口。目前，分子生物学技术在抗性进化研究中的应用刚刚起步，有待于深入和发展。与此同时，我们也应清醒的认识到微观技术研究有其自身的局限性，因此我们应站在宏观进化生态学高度在理论、方向上进行指导，只有宏观与微观有机地结合起来，植物抗性进化研究才可能有更大的突破。